TERAPIA GÉNICA EX VIVO PARA PRODUCIR HUESO USANDO DIFERENTES TIPOS CELULARES

Douglas S. Musgrave, M.D*, Patrick Bosch, M.D. ^#* ,Steve Ghivizzani, Ph.D.^@ Janey Whalen, Ph.D. * Christopher Niyibizi, Ph. D. Jonny Huard Ph.D. ^#*^@.

Laboratorio para crecimiento y desarrollo Departamento de cirugía ortopédica* y genética molecular y bioquímica,^@ Universidad de Pittsburgh.

INTRODUCCION

La terapia génica e ingeniería de tejidos prometen revolucionar la cirugía ortopédica. Hace treinta años, el Dr. Marshall Urist observó que la matriz ósea desmineralizada contiene factores osteoinductores, y que las células osteocompetentes pueden existir fuera del hueso^7,8. La proteína morfogénica del hueso-2 (Bone morphogenetic protein-2, BMP-2) es uno de éstos factores osteoinductores y la inyección de BMP-2 humano recombinante induce la formación de hueso⁹. Las estrategias actuales en terapia génica para administrar BMP-2 optimizan la administración, sea celular o por otros medios. Este estudio evalúa las ventajas y desventajas del uso de una línea celular del estroma de la médula ósea, células primarias de estroma de médula ósea, células primarias derivadas de músculo, controcitos articulares primarios, y fibroblastos primarios de la piel, en terapia génica ex vivo para suministrar BMP-2.

METODOS

Poblaciones Celulares

Una línea celular del estroma de la médula ósea (OIMSC) de un modelo murino de osteogénesis imperfecta humana (OI) nos fue gentilmente donada (Laboratorio Ferguson, Universidad de Pittsburgh) y fue mantenida en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero fetal bovino (fetal bovine serum FBS), 1% penicilina/estreptomycina (P/S), y 1% L-glutamina. Células primarias de médula ósea (bone marrow stromal cells, BMSCs) fueron aisladas de ratones adultos emparentados normales y mantenidas en DMEM suplementado con 10% FBS, 1% P/S y 1% L-glutamina. Células primarias derivadas de músculo fueron aisladas de ratones normales adultos siguiendo una técnica anteriormente descripta^4,5 y mantenidas en DMEM suplementado con 10% FBS, 1% P/S. Condrocitos primarios articulares fueron aislados siguiendo una técnica anteriormente descripta¹ y mantenidas en medio F-12 de Ham suplementado con 10% FBS, 1% P/S (Laboratorio Ferguson). Fibroblastos primarios de la piel fueron obtenidos de biopsias de conejos blancos New Zealand y mantenidas medio F-12 de Ham suplementado con 10% FBS, 1% P/S (Laboratorio Ferguson).

Construccion del Vector Viral.

Un plásmido conteniendo el cDNA para BMP-2 nos fue provisto (Genetics Institute, Cambridge, MA) para la construcción de la primerageneración de un vector adenoviral, deficiente en la replicación, bajo el control del promotor del CMV (en el laboratorio de P.D.Robbins, Ph.D.).

Secreción de BMP-2 In Vitro.

Se cuantificó, para cada tipo celular, la secreción in vitro de BMP-2 después de la infección por AdBMP-2. Igual número de células fueron plaqueadas en placas de 12 pocillos, infectadas con AdBMP-2, y se permitió durante 72 horas la secreción de BMP-2. Las células control no fueron infectadas con AdBMP-2. Luego de 72 horas se recolectaron los sobrenadantes y se contaron las células. La infección por AdBMP-2 se hizo por cuadruplicado para permitir el análisis estadístico.

La cantidad de BMP-2 en los sobrenadantes fue determinada por el ensayo de inmunoadsorsión ligado a enzima (enzime linked immunosorbent assay, ELISA). El anticuerpo primario era un anticuerpo monoclonal de ratón contra BMP-2 (Genetics Institute, Cambridge, MA) y el anticuerpo secundario era un anticuerpo de cabra contra anticuerpo de ratón, conjugado con peroxidasa de rabanito. Además se incluyeron pocillos para controles negativos (medio sólo) y pocillos de control positivo conteniendo concentraciones conocidas de rhBMP-2 para obtener una curva de calibración usada para determinar la cantidad de BMP-2 secretada por los diferentes tipos celulares.

Ensayo de la Fosfatasa Alcalina.

Se estableció la respuesta osteogénica a rhBMP-2 in vitro mediante la cuantificación de la producción de fosfatasa alcalina. Se plaquearon igual número de células en placas de 12 pocillos y en los días 1, 3, y 5 se las estimuló con 200 ng/ml de rhBMP-2 (Genetics Institute, Cambridge, MA). No se estimuló a las células control. Al día 6 se contaron las células y se lisaron por ciclado térmico. Se determinó la actividad de la fosfatasa alcalina usando un kit comercial (Sigma Diagnostics, St. Louis MO). Los datos se expresan en unidades por litro por cada 1x10⁶ células. Todo el proceso descripto se realizó por cuadruplicado para poder hacer análisis estadístico (prueba t de Student)

Formación de hueso in vivo

Las células fueron co-transfectadas en días sucesivos con un retrovirus que codifica para una enzima beta-galactosidasa de localización nuclear y con AdBMP-2. Las células fueron luego tripsinizadas y resuspendidas en alícuotas de 20m l (5x10⁵ células) de HBSS e inyectadas en el músculo triceps surae de ratones SCID adultos. Los controles fueron animales separados inyectados con las mismas células no transfectadas.

En las semanas 2, 3, 4, y 5 después de la inyección se sacrificaron los animales. Se tomaron radiografías y secciones histológicas congeladas de los miembros posteriores. La tinción histológica incluyó la tintura de von Kossa, hematoxilina - eosina (H&E), y tintura X-gal para la reacción con beta galactosidasa. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Protección de Animales de Investigación de la institución.

RESULTADOS

Ver figuras 1-7.

DISCUSION

Este estudio establece la posibilidad del uso de células del estroma de la médula ósea, condrocitos articulares primarios, fibroblastos primarios de la piel, y una línea celular del estroma de la médula ósea de osteogénesis imperfecta, en terapia génica ex vivo para producir hueso. Los datos del ELISA demuestran que luego de haber sido transfectadas con AdBMP-2 todos los tipos celulares secretaron nanogramos de BMP-2 durante 3 días (Figura 1). Esta cantidad es 1000 veces menor que los microgramos de rhBMP-2 exógenos necesarios para inducir la formación de hueso⁹. Los datos del ensayo in vitro de la fosfatasa alcalina revelan un significativo potencial osteogénico de las OIMSCs y de las células primarias derivadas de músculo (Figura 2). Los cortes histológicos revelan OIMSCs marcados y células derivadas de músculo en lugares normalmente ocupadas por osteocitos y osteoblastos, lo cual apoya su osteocompetitividad (Figuras 3 y 4). Por último, las OIMSCs y las células derivadas de músculo produjeron cantidades de hueso detectables radiológicamente en 2 semanas, indicando su eficiencia en la formación de hueso. Por el contrario, los fibroblastos no mostrsron osteocompetitividad in vitro (Figura 2), produjeron hueso solamente detectable por microscopía y no fueron encontrados en ubicaciones normalmente ocupadas por células osteogénicas (Figura 7). La osteocompetitividad de las BMSCs primarias y los condrocitos articulares fue intermedia (Figuras 2, 5 y 6). Estos datos muestran las ventajas y desventajas del uso de cada uno de los tipos celulares en terapias génicas ex vivo para producir hueso. Cada tipo celular, con sus propias y distintivas características favorables puede tener un rol en aplicaciones de terapia génica musculoesquelética.

REFERENCIAS

Green WT. Behaviour of articular chondrocytes in cell culture. Clin Orthop 75:248-260; 1971.

Lieberman JR, Le LQ, Wu L et al. Regional gene therapy with a BMP-2-producing murine stromal cell line induces heterotopic and orthotopic bone formation in rodents. J Orthop Res 16:330-9; 1998

Musgrave DS, Bosch P, Ghivizzani S et al. Adenovirus-mediated direct gene therapy with BMP-2 produces bone. Bone 24(6); 1999

Qu Z. Balkir L, van Deutekom CT, Robbins PD, Pruchnic R. Development of approaches to improve cell survival in mioblast trasfer therapy. J Cell Biol 142:1257-1267, 1998.

Rando TA, Blau HM. Primary mouse mioblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol 125(6): 1275-1287; 1994

Riew KD, Wright NM, Cheng S et al. Induction of bone formation using a recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene in a rabbit spinal fusion model. Calcif Tiss Int 63(4):357-360; 1998.

Urist MR. Bone: formation and autoindiction. Science 150: 893-99, 1965.

Urist MR, Hay PH, Dubuc F, Buring K. Osteogenetic competence. Clin Orthop 64: 195-220; 1967.

Wang EA, Rosen V, D’Assandro JS, et al . Recombinant human bone morphogenetic protein indices bone formation. PNAS USA 87:2220-2224; 1990

Figura 1: Cantidad de BMP-2 en sobrenadantes celulares determinados mediante ELISA. Los sobrenadantes fueron recolectados tres dias después de la infección por AdBMP-2.

Figura 2: Producción de fosfatasa alcalina en respuesta a estimulación por rhBMP-2 (200 ng/ml) durante 5 días.

Figura 3: OIMSCs – tres semanas.

A: radiografía de hueso ectópico en la musculatura de un miembro posterior. B: Tinción H&E mostrando un tumor de células y osteoide de aspecto inmaduro. C: Tinción de v Kossa mostrando hueso mineralizado. D: Células marcadas ocupando la posición de osteoblastos (flechas negras) y osteocitos (flechas blancas)

Figura 4: Células derivadas de músculo. 3 semanas.

A: radiografía de hueso ectópico en la musculatura de un miembro posterior. B: Tinción H&E mostrando hueso rodeando espacios trabeculares y miofibras protruyentes (m) C: Tinción de v Kossa mostrando hueso mineralizado. D: Células marcadas ocupando la posición de osteoblastos (flechas negras) y osteocitos (flechas blancas).

Figura 5: BMSCs – 3 semanas.

A: Radiografia mostrando la densidad de tejidos blandos posteriores. B: Tinción H&E mostrando islotes de hueso y células mononucleares infiltradas en las miofibras (m). C: Tinción de von Kossa mostrando hueso mineralizado aislado. D: Células marcadas (flecha blanca) dentro del estroma fibroso; algunas células (flecha negra) tapizando el osteoide.

Figura 6: Condrocitos – 3 semanas.

A: Radiografia mostrando la densidad de tejidos blandos posteriores sin muestras definitivas de osificación. B: Tinción H&E mostrando hueso rodeando espacios trabeculares. C: Tinción de v Kossa mostrando hueso mineralizado protruyendo directamente de musculo esquelético. D: Las pocas células marcadas encontradas se hallan tapizando (flecha negra) y dentro (flecha blanca) del osteoide.

Figura 7: Fibroblastos – 3 semanas.

A: Radiografía sin evidencias de hueso ectópico. B: Tinción H&E mostrando hueso ectópico rodeando miofibras ectópicas (*). C: Tinción de von Kossa mostrando hueso mineralizado íntimamente adjacente a las miofibras. D: Células marcadas (azules) dentro del estroma entremezcladas con miofibras (*), no se aprecian células tapizando el osteoide.